Özgün Araştırma

Kutanöz Leishmaniasiste Deneyimli Uzman ve Rutin Mikrobiyoloji Laboratuvarı Tarafından Yapılan Lezyonal Yaymaların Tanısal Değeri

10.4274/tdd.galenos.2018.3812

  • İsa An
  • Mehmet Harman
  • İbrahim Çavuş
  • Ahmet Özbilgin

Gönderim Tarihi: 16.08.2018 Kabul Tarihi: 08.10.2018 Turk J Dermatol 2019;13(1):1-5

Amaç:

Leishmaniasis, 98 ülkede 12 milyon insanı etkileyen vektör kaynaklı yaygın bir enfeksiyondur. Tanıda en sık kullanılan yöntem leishmania yaymaların mikroskobik incelemesidir. Bu yöntemin tanısal değeri değerlendiricinin deneyimine göre değişkenlik gösterir. Bu çalışmada kutanöz leishmaniasis tanısında lezyonal yaymaların değerlendirilmesinde deneyimin ne kadar önemli olduğunun saptanması amaçlandı.

Yöntemler:

Bu çalışmaya 2016 yılının Ocak ve Aralık ayları arasında Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Deri ve Zührevi Hastalıklar Polikliniği’ne başvuran ve deri leishmaniasisi kuşkusu uyandıran lezyonlara sahip hastalar alındı. Bu hastaların tümünden hem rutin mikrobiyoloji laboratuvarında hem de kutanöz leishmaniasisin klinik ve tanısında deneyimli uzman tarafından olmak üzere ayrı yaymalar yapıldı ve birbirlerinden bağımsız olarak değerlendirildi.

Bulgular:

Çalışmaya alınan 98 olgunun 70’inde kutanöz leishmaniasis tanısı laboratuvar değerlendirmeleri ile doğrulandı. Kutanöz leishmaniasisin klinik ve tanısında deneyimli uzman tarafından yapılan yaymaların pozitifliği (%95,7) rutin mikrobiyoloji laboratuvarı tarafından yapılan yaymaların pozitifliğinden (%42,9) yüksekti (p<0,001).

Sonuç:

Çalışmamızdaki veriler gösterdi ki kutanöz leishmaniasis tanısı için yaymalar kutanöz leishmaniasisin klinik ve tanısında deneyimli uzmanlar tarafından yapılmalı ve değerlendirilmelidir.

Anahtar Kelimeler: Kutanöz leishmaniasis, yayma, tanı, GZ-PZR, kültür

Giriş

Leishmaniasis, leishmania cinsi protozoonların neden olduğu, deri lezyonlarından sistemik hastalıklara uzanan geniş spektrumlu multisistemik bir hastalıktır. Kutanöz leishmaniasis (KL) deride uzun süren nodülo-ülseratif lezyonlarla seyredip atrofik skatrisle iyileşen bir deri hastalığı tablosudur. Hastalığın klinik ve epidemiyolojik özellikleri parazitler, konak ve çevreyi içeren çok sayıda faktörün rol oynamasına bağlı olarak değişmektedir (1-3).

KL tanısı; mikroskobik inceleme, kültür ortamında izolasyon, genomda bulunan spesifik dizilerin moleküler yöntemlerle incelenmesi yöntemleri ile veya hasta serumunda antikorların arandığı serolojik testlerle yapılabilmektedir. Direkt mikroskopide amastigotların görülebilirliği tecrübe gerektirir. Literatürde bu yöntemle olgularda %30 ile %96,2 arasında değişen oranlarda hastalık etkeni mikroorganizmaların saptandığı bildirilmektedir. Bu oranların farklı olmasında; lezyondan materyal alma yeri ve yöntemi, yaymaların hazırlanma biçimi ve mikroskobik incelemeyi yapan kişinin deneyimi etkili olmaktadır (4,5).

Bu çalışmada KL tanısında lezyonal yaymaların değerlendirilmesinde deneyimin ne kadar önemli olduğunun saptanması amaçlandı.


Yöntemler

Çalışmaya 2016 yılının Ocak ve Aralık ayları arasında, Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Deri ve Zührevi Hastalıklar Polikliniği’ne başvuran her yaş ve cinsiyetten, öykü-fizik muayene ile KL olduğu düşünülen 98 hasta dahil edildi. Bu hastalar arasında tanısı doğrulanan 70 olgu değerlendirildi.

Deri ve zührevi hastalıklar polikliniği’ne başvuran ve KL düşünülen hastalar ilk önce rutin mikrobiyoloji laboratuvarına yönlendirildi. Burada her hastadan 2 adet yayma preparat hazırlanıp mikroskobik inceleme yapıldı. Daha sonra aynı hastalar KL’nin klinik ve tanısında deneyimli uzman tarafından değerlendirildi. Papül, nodül, plak gibi solid lezyonlardan sitolojik örnek almak için dermal kazıntı yöntemi kullanıldı. Örnek alınacak bölge alkollü spanç ile silindikten sonra solid lezyonlar dominant olmayan elin baş ve işaret parmağı arasında sıkıştırıldı, bistüri (15 numara) yardımı ile yaklaşık 5 mm uzunluğunda ve 2-3 mm derinliğinde minik bir insizyon yapıldı. Bistüri ile dermal bölgeden kazıntı yapılarak elde edilen materyaller lam üzerine yayıldı. Üzeri krutlu ülsere lezyonlarda ise bistüri ile krut bir kenarından hafifçe kaldırıldıktan sonra açığa çıkan ülser yüzeyinden bistüri ile kazıntı yapıldı. Direkt mikroskobik inceleme için alınan örnek lam üzerine ince bir şekilde yayıldı. Tüm hastalardan en az 4 adet yayma hazırlandı. Bu yaymaların 2’si metil alkolle tespit edildikten sonra Giemsa ile boyanarak mikroskop altında leishmania amastigotlarının varlığı açısından en az 5 dakika süre ile incelendi. Mikroskobik incelemede, yuvarlak veya oval şekilli, bir köşede koyu mor renkli nükleusu ve bunun hemen yanında kinetoplastı bulunan, sitoplazması soluk mavi renkte yapılar seklinde görülen amastigot bulunduran yaymalar pozitif olarak kabul edildi.

Hastalardan alınan 4 preparatın ikisi ise moleküler çalışmalarda kullanılmak üzere -20˚C’de saklandı.

Kültür için lezyondan elde edilen örnekten modifiye Novy-Macneal-Nicolle (NNN) besiyerlerine ekim yapıldı. Besiyerleri 260 °C’de saklanmış ve promastigotların varlığı açısından bir ay süreyle gün aşırı kontrol edildi. İlk üremenin gerçekleştiği besiyerlerinden örnekler alındı. Alınan örnekler fazla miktarda üretmek amacıyla Media Designed at Roswell Park Memorial Institute-1640 besiyerinde kültüre alındı.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile genotiplendirme çalışmalarında, leishmania parazitlerinin ssu rRNA ve 5,8S rRNA’yı kodlayan genleri ayıran ribozomal internal transcribed spacer 1 bölgesi primer ve probları kullanılarak gerçek zamanlı (GZ)-PZR testi uygulandı (6).

Preparatlar steril bir bistüri yardımıyla steril bir petri içerisine kazınarak preparat üzerindeki materyal alındı. Bu materyal 1,5 mL’lik ependorf tüpüne aktarıldı ve 200 µL steril phosphate-buffered saline ilave edilerek, iyice karıştırıldı. Daha sonra DNA izolasyon işlemi gerçekleştirildi. DNA izolasyon işlemi ROCHE High Pure PCR Template Preparation Kit’i kullanılarak talimatlara uygun şekilde yapıldı.

GZ-PZR analiz işlemi için toplam 25 µL’lik reaksiyon karışımı (20-50 ng genomik DNA, 1,5 µL H20 (PCR grade water), 10 µm forward ve reverse primerlerden 1 µL, her bir 4 µm probe için 0,5 µL, 12,5 µL 2X QuantiTect Probe PCR Kit Master karışımı) hazırlandı.

GZ-PZR cihazında (Rotor-Gene® Q) uygulanan protokol; ön denatürasyon 95˚C 15 dakika devamında 40 döngü (95˚C 15 saniye denatürasyon, 50˚C 30 saniye bağlanma, 72˚C 20 saniye uzama), sonlanma 95˚C 1 dakika ve 40˚C 1 dakika daha sonra melting uygulanarak tür ayrımı yapılmıştı.


İstatistiksel Analiz

Çalışmaya dahil edilen hastaların tüm verileri istatiksel analiz SPSS 18.0 for Windows (SPSS Inc. Chicago, IL, USA) paket programı kullanılarak yapıldı. P değeri 0,05’in altında olduğunda anlamlı olarak kabul edildi.


Bulgular

Bu çalışmada öykü-fizik muayene ile KL olduğu düşünülen 98 hasta arasında tanısı çeşitli laboratuvar yöntemleri ile doğrulanan 70 hasta değerlendirmeye alındı. Tanısı doğrulanan hastaların tümünde kültür ve GZ-PZR pozitif idi.

Hastaların örneklerinden yapılan GZ-PZR analizlerinde 49 (%70) hastada L. tropica, 14 (%20) hastada L. major ve 7 (%10) hastada L. infantum/L. donovani tespit edildi (Tablo 1).

Rutin mikrobiyoloji laboratuvarı tarafından yapılan yaymalarda 30 (%42,9) olguda, KL’nin klinik ve tanısında deneyimli uzman tarafından yapılan yaymalarda ise 67 (%95,7) olguda pozitiflik tespit edildi (p<0,001).

Rutin mikrobiyoloji laboratuvarı tarafından yapılan yaymalarda, KL’nin klinik ve tanısında deneyimli uzman tarafından yapılan yaymalarda, modifiye NNN kültürde ve GZ-PZR’de pozitiflik oranları sırasıyla %42,9, %95,7, %100 ve %100 olarak saptandı (p=0,048) (Tablo 2).


Tartışma

Ülkemizde KL sık görülen bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Özellikle Akdeniz ve Güneydoğu Anadolu bölgesinde görülmesine rağmen, diğer bölgelerde de sporadik olgular bildirilmektedir (7-9).

L. tropica ve L. major başlıca Akdeniz havzası, Ortadoğu, Kafkasya ve Orta Asya’da, sıklıkla visseral hastalık yapan L. infantum Akdeniz’e kıyısı olan ülkelerde KL’ye yol açar (2,8,9).

Eroğlu ve ark., (8) KL’li hasta örneklerinden izole edilen leishmania izolatlarının tiplendirildiği çalışmalarda %31,5 oranında L. infantum, %68,5 oranında L. tropica bildirilmiştir. Serin ve ark., (10) KL olgularının %30’unda L. infantum ve %70’inde L. tropica tespit etmişlerdir. Özbilgin ve ark., (11) 2011-2014 yılları arasında Türkiye’de L. majorun etken olduğu 18 KL olgusu bildirmişlerdir. Türkiye’de L. major enfeksiyonlarının görülme sıklığındaki artış birkaç faktöre bağlanmıştır. Bu faktörlerden en önemlisi Türkiye’nin komşuları olan Irak ve Suriye’den olan mülteci göçüdür.

Bizim çalışmamızda Türkiye’de yapılan çalışmaları kapsayan literatür bilgileriyle uyumlu olarak 49 (%70) hastada L. tropica, 14 (%20) hastada L. major ve 7 (%10) hastada L. infantum/L. donovani tespit edilmiştir.

KL klinik olarak birçok deri hastalıklarını taklit edebilir. Bu nedenle KL tanısı mutlaka laboratuvar tanısı ile doğrulanmalıdır. KL tanısı; mikroskobik inceleme, kültür ortamında izolasyon, genomda bulunan spesifik dizilerin moleküler yöntemlerle incelenme, antijenlerinin gösterildiği (direkt aglütinasyon testi, rK39) direkt yöntemler veya hasta serumunda antikorların arandığı serolojik testlerle yapılabilmektedir (12-16). PZR tabanlı yöntemler düşük parazit yükü bulunan olguları bile iyi analiz edebilmesinden dolayı özellikle düşük parazit yükü bulunan olgularda tercih edilir (17,18).

Mikroskobik inceleme basit, ucuz bir yöntemdir. Literatürde bu yöntemle olguların %30 ile %96,2 arasında değişen oranında hastalık etkeni mikroorganizmaların saptandığı bildirilmektedir (4,5,19-26) (Tablo 3).

Bizim çalışmamızda rutin mikrobiyoloji laboratuvarı tarafından yapılan incelemede olguların %42,9’unda (30 olgu), KL konusunda KL’nin klinik ve tanısında deneyimli uzman tarafından yapılan incelemede ise olguların %95,7’sinde (67 olgu) amastigotlar saptanmıştır.

KL klinik ve tanısında deneyimli uzmanın smear pozitiflik oranın yüksek olmasının nedenlerinin; hastalığın klinik ve anamnez bulgularını iyi bilmek, yayma hazırlama ve inceleme konusunda deneyimli olmak, çok sayıda yayma preparatı hazırlamak ve özellikle kronik olgularda yaymaların daha uzun süre incelenmesi olduğunu düşünmekteyiz.


Çalışmanın Kısıtlılıkları

Bu çalışmanın kısıtlılığı sadece yayma sonuçlarının değerlendirmesi nedeniyle deneyimin hangi aşamada etkili olduğunun saptanamamasıdır.

Çalışmamızda rutin mikrobiyoloji laboratuvarı tarafından yapılan yayma, KL’nin klinik ve tanısında deneyimli uzman tarafından yapılan yayma, modifiye NNN kültür yöntemi ve GZ-PZR pozitifliği sırasıyla %42,9, %95,7, %100 ve %100 olarak saptandı. Bu sonuçlara dayanılarak GZ-PZR ve modifiye NNN kültür laboratuvar yöntemlerinin KL tanısında yüksek duyarlılık ve özgünlüğe sahip olduğu söylenilebilir.

Dermatologlar KL’nin tanısı için basit, kolay uygulanabilen ve ucuz bir yöntem olan sitolojik incelemeye gerekli önemi vermemektedirler. Bu nedenle yaymalar, genellikle mikrobiyologlar tarafından değerlendirilmektedir. Sitolojik inceleme konusunda deneyimli olan dermatologlar tarafından yapılacak olan sitoloji kursları ile dermatologlar, yayma konusunda özendirilmelidir.


Sonuç

Sonuç olarak çalışmamızdaki veriler gösterdi ki KL tanısı için yaymalar KL’nin klinik ve tanısında deneyimli uzman tarafından alınmalı ve değerlendirilmelidir.

Etik

Etik Kurul Onayı: Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu tarafından 27.02.2015/153 sayılı etik kurul onayı alınmıştır.

Hasta Onayı: Hastalardan yazılı onam formu alınmıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Konsept: İ.A., Dizayn: İ.A., M.H., Veri Toplama veya İşleme: İ.A., M.H., İ.Ç., A.Ö., Analiz veya Yorumlama: M.H., Literatür Arama: İ.A., Yazan: İ.A., M. H.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.


Resimler

  1. Uzun S, Gürel MS, Durdu M, et al. Clinical practice guidelines for the diagnosis and treatment of cutaneous leishmaniasis in Turkey. Int J Dermatol 2018;57:973-82.
  2. Salman IS, Vural A, Unver A, et al. Cutaneous leishmaniasis cases in nizip, Turkey after the Syrian civil war. Mikrobiyol Bul 2014;48:106-13.
  3. Turhanoglu M, Alp Erdal S, Bayindir Bilman F. A nine-year evaluation of cutaneous leishmaniasis patients in Diyarbakir Training and Research Hospital, Turkey. Mikrobiyol Bul 2014;48:335-40.
  4. Khatri ML, Di Muccio T, Gramiccia M. Cutaneous leishmaniasis in North-Western Yemen: a clinicoepidemiologic study and leishmania species identification by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis. J Am Acad Dermatol 2009;61:e15-21.
  5. Rahman SB, Bari AU. Laboratory profile in patients of cutaneous leishmaniais from various regions of Pakistan. J Coll Physicians Surg Pak 2003;13:313-36.
  6. Özensoy Toz S, Çulha G, Yıldız Zeyrek F, et al. A real-time ITS1-pcr based method in the diagnosis and species identifications of leishmania parasite from human and dog clinical samples in Turkey. Plos Negl Trop Dis 2013;7:e2205.
  7. Özbilgin A, Harman M, Karakuş M, et al. Leishmaniasis in Turkey: visceral and cutaneous leishmaniasis caused by leishmania donovani in Turkey. Acta Trop 2017;173:90-6.
  8. Eroğlu F, Koltas IS, Genc A. Identification of causative species in cutaneous leishmaniasis patients using PCR-RFLP. J Bacteriol Parasitol 2011;2:113.
  9. Harman M. Kutanöz leishmaniasis. Turkiye Klinikleri J Dermatol-Special Topics 2017;10:125-32.
  10. Serin MS, Daglioglu K, Bagirova M, et al. Rapid diagnosis and genotyping of Leishmania isolates from cutaneous and visceral leishmaniasis by microcapillary cultivation and polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism of miniexon region. Diagn Microbiol Infect Dis 2005;53:209-14.
  11. Özbilgin A, Çulha G, Uzun S, et al. Leishmaniasis in Turkey: first clinical isolation of Leishmania major from 18 autochthonous cases of cutaneous leishmaniasis in four geographical regions. Trop Med Int Health 2016;21:783-91.
  12. Harman M. Kutanöz Leishmaniasis. Turk J Dermatol 2015;9:168-76.
  13. Koltas IS, Eroglu F, Uzun S, et al. A comparative analysis of different molecular targets using PCR for diagnosis of old world leishmaniasis. Exp Parasitol 2016;164:43-8.
  14. Koltas IS, Eroglu F, Alabaz D, et al. The emergence of Leishmania major and Leishmania donovani in southern Turkey. Trans R Soc Trop Med Hyg 2014;108:154-8.
  15. Başsorgun Cİ, Ünal B, Karakaş AA, et al. Clinicopathological evaluation of cutaneous leishmaniasis in the mediterranean region of Turkey. Turk Patoloji Derg 2015;31:126-30.
  16. Eroglu F, Koltas IS, Alabaz D, et al. Clinical manifestations and genetic variation of Leishmania infantum and Leishmania tropica in Southern Turkey. Exp Parasitol 2015;154:67-74.
  17. Graça GC, Volpini AC, Romero GA, et al. Development and validation of PCR-based assays for diagnosis of American cutaneous leishmaniasis and identification of the parasite species. Mem Inst Oswaldo Cruz 2012;107:664-74.
  18. Azmi K, Nasereddin A, Ereqat S, et al. Methods incorporatinga polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism and their use as a’gold standard’ in diagnosing Old World cutaneous leishmaniasis. Diagn Microbiol Infect Dis 2011;71:151-5.
  19. Dar NR, Khurshid T. Comparison of skin smears and biopsy specimens for demonstration of leishmania tropica bodies in cutaneous Leishmaniasis. J Coll Physicians Surg Pak 2005;15:765-67.
  20. Aviles H, Belli A, Armijos R, et al. PCR detection and identification of Leishmania parsites in clinical specimens in ecuador: a comparison with classical diagnostic methods. J Parasitol 1999;85:181-7.
  21. Rodriguez N, Guzman B, Rodas A, et al. Diagnosis of cutaneous leishmaniasis and species discrimination of parasites by PCR and hybridization. J Clin Microbiol 1994;32:2246-52.
  22. Tareen A, Afaq S, Haque AU. Comparative study of the diagnosis of cutaneous leishmaniasis by slit skin smear and skin biopsy for histopathology. JRMC 2014;18:83-6.
  23. Gurel MS, Ulukanligil M, Ozbilge H. Cutaneous leishmaniasis in Sanliurfa:epidemiologic and clinical features of the last four years (1997-2000). Int J Dermatol 2002;41:32-7.
  24. el-Safi SH, Peters W, el-Toam B, et al. Studies on the leishmaniases in the Sudan. 2. Clinical and parasitological studies on cutaneous leishmaniasis. Trans R Soc Trop Med Hyg 1991;85:457-64.
  25. Uzun S, Uslular C, Yucel A, et al. Cutaneous leishmaniasis: evaluation of 3,074 cases in the Cukurova region of Turkey. Br J Dermatol 1999;140:347-50.
  26. Sharquie KE, Hassen AS, Hassan SA, et al. Evaluation of diagnosis of cutaneous leishmaniasis by direct smear, culture and histopathology. Saudi Med J 2002;23:925-8.